本文原作者：尹一恒
作者单位：第四军医大学
原标题：海参皂苷fuscocinerosideA抑制人脑胶质母细胞瘤U251细胞生长实验研究
以下实验内容专业术语较多，急于得到结论的读者可以重点看漂红部分，或下拉到最后。

脑胶质细胞瘤是颅内最常见的肿瘤，它起源于正常的星形细胞或其前体祖细胞；而胶质母细胞瘤是最凶险、也是最常见的一种恶性胶质瘤，它在脑实质弥漫性浸润的特性加上对普通化疗药物的相对耐药性以及射线的不敏感性，导致目前包括外科治疗在内的各种综合治疗效果均不佳，其中位生存期据文献统计只有9～12个月，迫切需要新的治疗方案或新的敏感药物问世。

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海参广泛存在于我国的海洋中，它的主要次生代谢产物三萜皂苷不仅具有抗病毒、抗真菌及抗凝血等活性，而且其抗癌作用也很显著。FuscocinerosideA系从棕环海参(holothuria fuscocinerea jaeger)代谢物中新分离出的一种三萜苷，在药物筛选实验中表现出对肿瘤细胞有很强的杀伤作用，但其作用机制尚未清楚。本文就海参皂苷fuscocinerosideA对人源性胶质母细胞瘤U251细胞系增殖的抑制作用进行研究，并探讨其作用机制，为fuscocinerosideA作为抗肿瘤新药的开发及临床应用提供理论依据。

实验一，低剂量fuscocinerosideA对人脑胶质母细胞瘤U251细胞的体外生长影响及主要作用机制。
四甲基偶氮唑蓝(MTT)细胞增殖实验显示fuscocinerosideA对人脑胶质母细胞瘤U251细胞有显著的生长抑制作用，有明显的剂量和时间依赖性；fuscocinerosideA作用U251细胞48h的IC50及IC75分别为7.8±0.3μM（**P<0.01）和15.4±0.5μM（**P<0.01）；而fuscocinerosideA对正常胶质细胞毒性作用甚微，仅在本实验处理的最大剂量32μM经过72h，表现出有统计学差异的变化，生存率降为82.3％（料P<0.01）；说明在正常胶质细胞能够耐受的剂量窗内即能对U251胶质母细胞瘤细胞有明显的杀伤作用。

与阴性对照相比，高于4μM的fuscocinerosideA对U251胶质母细胞瘤细胞的生长抑制更具有统计学意义（**P<0.01）。本实验定义<4μMfuscocinerosideA作为实验的低剂量处理。

我们首先探讨低剂量fuscocinerosideA对人脑胶质母细胞瘤U251细胞生长抑制的影响。与阴性对照组相比，2μMfuscocinerosideA对U251细胞的生长抑制无明显的统计学意义(P>0.05)；用4μMfuscocinerosideA处理U251细胞，分别经过24h、48h及72h的作用，存活率分别降为80.3％、75.5％及71.1％（*P<0.05）；镜下观察其形态学变化表现为细胞生长停滞，分裂期细胞消失；为进一步探讨低剂量fuscocinerosideA对胶质母细胞瘤细胞生长抑制的作用机制，我们用O、2μM及4μM的fuscocinerosideA分别处理U251细胞24h，并检测其细胞周期的变化。结果表明，处理组U251细胞的Go/Gi期细胞百分比含量明显增加，并随处理浓度增大而增加，而S期和G2/M期细胞百分比含量减少，提示低剂量fuscocinerosideA能够引起U251细胞发生Gi期阻滞；在实验中未发现有“亚Gi峰”出现，表明未有显著的凋亡发生，这进一步通过DNA琼脂糖凝胶电泳得到证实。

Westernblot结果显示，未处理的U251胶质母细胞瘤细胞中p53、p27kip-l和p21waf－1蛋白表达含量较少，这与U251细胞的高度恶性肿瘤特性具有一致性；而经4μM的fuscocinerosideA处理后的U251细胞中的p53、p27kip-l和p21waf－1蛋白表达都有明显的增多，且伴有时间依赖性。上述结果说明低剂量fuscocinerosideA诱导的人脑胶质母细胞瘤U251细胞Gi期阻滞与p27kip-l的上调以及p53介导的p2waf-1的表达升高有关。

实验二，高剂量fuscocinerosideA对人脑胶质母细胞瘤U251细胞的体外生长影响及主要作用机制
用7.8μM或更大剂量的fuscocinerosideA对U251胶质母细胞瘤细胞处理，流式细胞仪检测细胞周期显示不但有明显的Go/Gi期阻滞，并且有典型的细胞凋亡特征一“亚Gi峰”的出现；提示fuscocinerosideA对肿瘤细胞的抑制作用存在多条细胞内信号传导途径。用7.8μMfuscocinerosideA作用U251人脑胶质母细胞瘤细胞12h，即可在光镜下观察到部分细胞形态开始变化，出现贴壁细胞离壁、变圆等改变；而经过作用24h或者更长时间，HE染色观察到细胞皱缩，体积变小，胞浆明显减少，胞核凝集浓染；

Hoechst33342荧光染色观察到染色质凝聚，有典型的核固缩和核碎裂；透射电镜观察到细胞微绒毛消失，溶酶体增多，染色质浓集，边集于胞膜下，呈团块状分布并有凋亡小体出现；末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记(TUNEL)检测发现胞核在荧光显微镜下激发出黄绿色荧光，并有核碎裂、核固缩及凋亡小体出现；DNA琼脂糖凝胶电泳出现凋亡细胞特征性的“梯状”条带；Westernblot结果显示survivin在U251人脑胶质母细胞瘤细胞中高表达，同样，这与U251细胞的肿瘤特性相符；而经高剂量fuscocinerosideA处理后survivin蛋白表达显著降低；我们还发现高剂量fuscocinerosideA较低剂量的fuscocinerosideA更能显著提高p53、p27kip-1和p21waf1蛋白的表达；同时caspase-3也被激活，裂解成19kD的活性片段，后者执行最后的凋亡过程。说明高剂量fuscocinerosideA诱导的U251人脑胶质母细胞瘤细胞凋亡与p53的表达升高以及survivin的下调有关，二者可能与caspase-3的激活有联系。

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结论：海参皂苷fuscocinerosideA能显著地抑制人脑胶质母细胞瘤U251细胞的增殖：在较低剂量作用下，主要为抑制肿瘤细胞的增殖，阻滞细胞周期进展在Gi期；而在较高浓度下，fuscocinerosideA不但能诱导Gi/S细胞周期阻滞，还能诱导肿瘤细胞的大量凋亡，并且对正常胶质细胞的毒性甚微。FuscocinerosideA诱导的Gi/S期阻滞与p27kip-l的上调以及p53介导的p2lwa-的表达升高有关，而其诱导的人脑胶质母细胞瘤U251细胞的凋亡与p53的表达升高以及survivin的表达下调有关，并与caspase3的激活而导致凋亡相关。